丙型肝炎达卡他韦的药品活性有效成分

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摘要

施贵宝公司发现了BMS-858 (Fig1)作为先导化合物,促成了后来的达卡他韦。

达卡他韦的产生是施贵宝公司为了发现新型的抗丙型肝炎药品,应用高通量筛选方式先后筛选了近一百万个化合物。当然,这么大规模的筛选是因为有了丙型肝炎复制子细胞模型,能够筛选出丙型肝炎特异性抑制剂,后来就发现了BMS-858 (Fig1)。BMS-858抑制丙型肝炎活性EC50仅在0.57μM~1.0μM,细胞毒性CC50> 50μM,虽然不理想,但是作为先导化合物已经足够了,于是药理学家和药品化学家们就忙起来了。
 
达卡他韦是通过抑制丙型肝炎的NS5A而发挥作用,但是在当时,NS5A蛋白能够做为抗丙型肝炎的靶点并不为人所知。在当时,NS3A和NS5B这两个靶点是抗丙型肝炎的已知的热门靶点,药理学家最初以为BMS-858是这两个靶点的抑制剂。然而,实验表明BMS-858对NS3A和NS5B无抑制作用,当时药理学家们就激动了,因为BMS-858可能作用新靶点啊!怎么找到BMS-858的作用靶点呢?药理学家经过多轮筛选,找到了对BMS-858耐受药物的细胞,经过分析发现是位于NS5A的氨基酸Tyr93发生了变化,而这些Tyr93发生变化的细胞对NS3A和NS5B抑制剂仍然敏感,这一定阶段上说明BMS-858作用于NS5A蛋白这个之前未被关注的靶点起到抗丙型肝炎作用。后来又以BMS-858的类似化合物BMS-824为工具化合物进行了验证,于是,找到了全新的抗丙型肝炎靶点NS5A蛋白。

 
药品化学家们对BMS-858研究时发现BMS-858这类结构在一些溶剂和复制子筛选介质中均不稳定丙型肝炎达卡他韦的药品活性有效成分,最初发现BMS-858不稳定是因为在进行活性测试前测了一下已经配好的BMS-858 DMSO溶液,结果发现BMS-858已经变质了!同样的,具有相同母核结构的BMS-824 (Fig1)也不稳定。科学家们冷静的考虑到,既然化合物BMS-824也在复制子筛选用的介质中不稳定,那么它为何会显示出~10nM的EC50?是分解之前产生的活性呢,还是分解后产生的物质具有活性?若是后者,肯定会发现具有新颖母核的化合物!于是,科学家开始进行实验研究。首先,将BMS-824在不含细胞的培养基中孵育72h,然后将含有化合物的培养基用乙腈提取,HPLC测定,结果发现,检查不到BMS-824的存在了,这充分说明BMS-824在培养基中已经分解利妥昔单抗(美罗华)RISTOVA。将HPLC中检查到的A和B两个物质进行分离。
 
A和B竟然没有明显的抗病毒活性!那么问题就来了,之前监控到的抗病毒活性是啥物质产生的呢?反思一下实验过程:将化合物放进培养基里面处置后仍有活性 - HPLC显示无母体化合物,但有两个主要物质 - 分离出的主要物质无活性。反思后应该能够想到只有一种可能,那就是有活性的物质没被分离出来!为何没被分离出来呢?要么含量太少检查不到,要么没有仪器检查器可检查到的讯号。为了找到活性物质都去哪了,研究人员将HPLC的流出液分段收集后浓缩测定活性,结果发现活性物质UV吸收非常弱,几乎和基线差不多高度,这说明活性物质的含量很少,但化合物活性很高。
 
为了分离鉴定出真正的活性物质,研究者将大量的BMS-824用培养基进行处置,最后分离得到了活性成分,经过结构鉴定为BMS-824的二聚物化合物C (Fig2)。
 

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